La
micropropagazione in vitro consiste nel prelevare piccole parti di
tessuti vegetali (gemme, apici vegetativi, porzioni di foglia) e
collocarli su un mezzo di coltura costituito da sali minerali,
vitamine, zuccheri e ormoni, in condizioni controllate al fine di
promuoverne lo sviluppo e la moltiplicazione.
La
micropropagazione consente di ottenere in tempo breve un grande
numero di piantine genotipicamente identiche alla pianta di partenza.
Questa
tecnica si basa sul fatto che le cellule vegetali sono totipotenti:
infatti, cellule già differenziate possono ridiventare
meristematiche, acquisendo la capacità di moltiplicarsi e originare
organi diversi da quelli da cui erano state prelevate.
E'
possibile indurre il meristema ad accrescersi in più punti,
producendo così un insieme di fusticini. Questi ultimi possono
essere poi separati e fatti radicare, ottenendo così un elevato
numero di piantine in tempi brevi.
Le
cellule meristematiche appartenenti a gemme ed apici vegetativi, non
essendo ancora differenziate possono estrinsecare appieno la loro
totipotenza, ma possono essere prelevati anche tessuti già
differenziati (porzioni di foglie, stelo, radici ). In questo caso il
substrato di coltura dovrà anche avere la proprietà di favorire il
riacquisto della capacità meristematica di cellule già
specializzate.
La
tecnica della micropropagazione in vitro risulta diffusa non soltanto nel
settore dell'arboricoltura (in particolare in frutticoltura), ma
anche nel florovivaismo (es. orchidee) e in orticoltura (fragole).
Vantaggi della micropropagazione in vitro
I vantaggi
che questa tecnica offre potrebbero essere riassunti in :
- ottenimento in tempo breve di moltissime piantine, tutte geneticamente identiche
- praticare il miglioramento genetico anche con tecniche biotecnologiche
- ottenimento di materiale sano anche partendo da piante virosate
- conservazione di cultivar locali o di particolare pregio
- propagazione di specie e cultivar difficilmente propagabili con altre metodiche
- possibilità di operare in qualsiasi periodo dell'anno e in spazi relativamente ristretti
Micropropagazione in vitro di piantina di vite Utilizzo della micropropagazione in vitro per il risanamento da virosi
Le
malattie virali rappresentano una grave problema per le piante coltivate. Esse infatti possono arrecare gravi danni alla pianta
e pregiudicare anche gravemente la produzione. La presenza di virus
può infatti comportare danni a fotosintesi, respirazione, trasporto
floematico, modificazioni del metabolismo dei carboidrati. Queste
alterazioni spesso comportano dei sintomi visibili (alterazioni delle
foglie, rami, fiori o frutti). Molte volte però la diagnosi del
virus presente in un vegetale è difficoltosa e può richiedere
complesse analisi di laboratorio. Inoltre non esistendo la
possibilità di effettuare trattamenti in campo gli unici mezzi di
controllo sono riconducibili all'adottare tecniche di prevenzione o
all'utilizzo di materiale di propagazione sano.
La distribuzione dei virus nelle piante non è uniforme, in quanto la loro presenza è elevata nei tessuti più vecchi, mentre negli apici meristematici la loro concentrazione è molto ridotta. La scoperta di questo presupposto teorico dell'impiego di meristemi per il risanamento da virosi risale agli anni 1930 - 40.
Le piante virus esenti si ottengono quindi prelevando una ridotta porzione di apice meristematico di piante in genere già sottoposte a termoterapia.
La
termoterapia
(applicata in vaso o in vitro)
è una metodica di risanamento da virosi che può essere
proficuamente abbinata alla micropropagazione nell'ottenimento di
piante virus - esenti.
Essa
consiste nel sottoporre materiale vegetale all'azione del calore al
fine di inattivare i virus in esso presenti. Può essere utilizzata
acqua o aria calda. Le temperature utilizzate, nel caso della vite
sono comprese tra i 37 e i 39°C, per periodi di 60 - 200 giorni.
Siccome è molto difficile che questo trattamento elimini
completamente tutti i virus presenti, la termoterapia viene
normalmente seguita da prelievo degli apici meristematici coltivati
in vitro, che
risultano appunto, privi di virus.
La
termoterapia può essere applicata anche a piante o germogli
coltivati in vitro; al
termine del trattamento viene eseguito il prelievo delle gemme
apicali o ascellari.
Preparazione dei substrati
I
meristemi e le porzioni di pianta prelevate per essere
micropropagate, vengono impiantati su appositi substrati aventi lo
scopo di favorirne la radicazione e l'accrescimento. La sua
composizione è pertanto fondamentale per la riuscita della coltura
stessa.
Sono fondamentali elementi nutritivi come azoto, potassio, calcio, fosforo, magnesio e altri in tracce come zinco, rame, ferro, iodio, cobalto. Ai sali di questi elementi vengono spesso aggiunti saccarosio e vitamine. A questi elementi viene aggiunto agar, un composto gelatinizzante avente lo scopo di solidificare il substrato.
A seconda
del tipo di substrato possono essere presenti ormoni, aventi varie
funzioni:
- le citochinine contrastano la dominanza apicale e favoriscono la proliferazione
- le gibberelline promuovono l'allungamento dei fusticini
- le auxine favoriscono la radicazione
Data l'importanza della assoluta sterilità l'acqua utilizzata deve essere ultrapura. I vari ingredienti vengono misurati con bilance di precisione, per evitare fenomeni di carenza o tossicità. Molto importante è anche il pH che viene portato al valore desiderato aggiungendo idrossido di sodio o acido cloridrico. In genere deve essere compreso tra 5.0 e 6.0, per favorire la completa disponibilità delle sostanze necessarie alla crescita.Sempre al fine di garantire la massima sterilità, il substrato, una volta distribuito in appositi contenitori viene posto in autoclave, dove l'azione del calore provvede ad eliminare eventuali patogeni indesiderati. I contenitori vengono chiusi e sigillati; dopo la sterilizzazione verrano aperti soltanto al momento dell'utilizzo.
Impianto delle colture
Il materiale da propagare viene prelevato da piante madri, avvalendosi di un microscopio binoculare per prelevare espianti molto piccoli, come nel caso di apici meristematici. La tecnica richiede elevata accuratezza e un buon grado di praticità ed esperienza, nonché il rispetto delle misure di asepsi.E' importante che il materiale venga sterilizzato mediante immersione in apposite soluzioni disinfettanti e lavato con acqua sterile. Le parti prelevate vengono poi poste sul substrato di coltura, a sua volta sterile.Tutte le operazioni di espianto vanno eseguite utilizzando strumenti sterili ed operando entro cappe a flusso laminare che sterilizzano l'aria che arriva sul piano di lavoro. Occorre evitare anche l'inquinamento del substrato, in quanto rappresenta un buon terreno di crescita anche per batteri e funghi.
Camere di coltura
Le piantine vengono poste in apposite camere con condizioni di temperatura, umidità e di luce controllate e variabili a seconda della specie e dello stadio di sviluppo. Le condizioni risultano così ottimali da garantire il corretto sviluppo della pianta.Prima di passare dal substrato gelatinoso al terreno in piena aria le piantine devono subire un graduale processo di acclimatazione. Esse si erano infatti sviluppate in condizioni ottimali e hanno limitati meccanismi di difesa da stress e parassiti. In un primo periodo viene pertanto utilizzata terra sterile fertilizzata e vengono garantiti elevati tenori di umidità. Dopo alcune settimane le piante possono crescere in condizioni normali in serra o all'aperto.
La pratica della micropropagazione, anche a scopo vivaistico, richiede l'ausilio di un laboratorio dove le varie operazioni possano essere eseguite rispettando le adeguate condizioni di sterilità. La strumentazione richiesta per poter operare è la seguente:- bilance di precisione, necessarie per pesare i componenti del substrato di coltura con assoluta esattezza
- pH-metro, per la misura del pH delle soluzioni e del mezzo di coltura
- forni e autoclavi per la sterilizzazione degli strumenti e dei substrati
- frigoriferi per la conservazione di alcuni prodotti chimici ( vitamine, sali, ormoni)
- vetreria, prodotti chimici, ingredienti per la preparazione del mezzo
- apparecchi per produrre acqua ultrapura
Le operazioni di espianto, trasferimento di meristemi, porzioni di gemma, richiedono aree sterili dotate di cappe a flusso laminare con rigorose condizioni di pulizia e sterilità per evitare il rischio di inquinamenti e contaminazioni.E' poi necessaria un'area in cui le piantine possano radicare e svilupparsi, in condizioni idonee e controllate. Per l'acclimatazione, può essere presente una serra.