La micropropagazione in vitro

La micropropagazione in vitro consiste nel prelevare piccole parti di tessuti vegetali (gemme, apici vegetativi, porzioni di foglia) e collocarli su un mezzo di coltura costituito da sali minerali, vitamine, zuccheri e ormoni, in condizioni controllate al fine di promuoverne lo sviluppo e la moltiplicazione. 

La micropropagazione consente di ottenere in tempo breve un grande numero di piantine genotipicamente identiche alla pianta di partenza.

Questa tecnica si basa sul fatto che le cellule vegetali sono totipotenti: infatti, cellule già differenziate possono ridiventare meristematiche, acquisendo la capacità di moltiplicarsi e originare organi diversi da quelli da cui erano state prelevate.

E' possibile indurre il meristema ad accrescersi in più punti, producendo così un insieme di fusticini. Questi ultimi possono essere poi separati e fatti radicare, ottenendo così un elevato numero di piantine in tempi brevi.

Le cellule meristematiche appartenenti a gemme ed apici vegetativi, non essendo ancora differenziate possono estrinsecare appieno la loro totipotenza, ma possono essere prelevati anche tessuti già differenziati (porzioni di foglie, stelo, radici ). In questo caso il substrato di coltura dovrà anche avere la proprietà di favorire il riacquisto della capacità meristematica di cellule già specializzate.

La tecnica della micropropagazione in vitro risulta diffusa non soltanto nel settore dell'arboricoltura (in particolare in frutticoltura), ma anche nel florovivaismo (es. orchidee) e in orticoltura (fragole).

Vantaggi della micropropagazione in vitro

I vantaggi che questa tecnica offre potrebbero essere riassunti in :

•  ottenimento in tempo breve di moltissime piantine, tutte geneticamente identiche
• praticare il miglioramento genetico anche con tecniche biotecnologiche
• ottenimento di materiale sano anche partendo da piante virosate
•  conservazione di cultivar locali o di particolare pregio
•  propagazione di specie e cultivar difficilmente propagabili con altre metodiche
• possibilità di operare in qualsiasi periodo dell'anno e in spazi relativamente ristretti
  
  

  

  Micropropagazione in vitro di piantina di vite

  
  

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

  Utilizzo della micropropagazione in vitro per il risanamento da virosi

Le malattie virali rappresentano una grave problema per le piante coltivate. Esse infatti possono arrecare gravi danni alla pianta e pregiudicare anche gravemente la produzione. La presenza di virus può infatti comportare danni a fotosintesi, respirazione, trasporto floematico, modificazioni del metabolismo dei carboidrati. Queste alterazioni spesso comportano dei sintomi visibili (alterazioni delle foglie, rami, fiori o frutti). Molte volte però la diagnosi del virus presente in un vegetale è difficoltosa e può richiedere complesse analisi di laboratorio. Inoltre non esistendo la possibilità di effettuare trattamenti in campo gli unici mezzi di controllo sono riconducibili all'adottare tecniche di prevenzione o all'utilizzo di materiale di propagazione sano. 

La distribuzione dei virus nelle piante non è  uniforme, in quanto la loro presenza è elevata nei tessuti più vecchi, mentre negli apici meristematici la loro concentrazione è molto ridotta. La scoperta di questo presupposto teorico dell'impiego di meristemi per il risanamento da virosi risale agli anni 1930 - 40.

Le piante virus esenti si ottengono quindi prelevando una ridotta porzione di apice meristematico di piante in genere già sottoposte a termoterapia.
 

La termoterapia (applicata in vaso o in vitro) è una metodica di risanamento da virosi che può essere proficuamente abbinata alla micropropagazione nell'ottenimento di piante virus - esenti.

Essa consiste nel sottoporre materiale vegetale all'azione del calore al fine di inattivare i virus in esso presenti. Può essere utilizzata acqua o aria calda. Le temperature utilizzate, nel caso della vite sono comprese tra i 37 e i 39°C, per periodi di 60 - 200 giorni. Siccome è molto difficile che questo trattamento elimini completamente tutti i virus presenti, la termoterapia viene normalmente seguita da prelievo degli apici meristematici coltivati in vitro, che risultano appunto, privi di virus.

La termoterapia può essere applicata anche a piante o germogli coltivati in vitro; al termine del trattamento viene eseguito il prelievo delle gemme apicali o ascellari.

Preparazione dei substrati

I meristemi e le porzioni di pianta prelevate per essere micropropagate, vengono impiantati su appositi substrati aventi lo scopo di favorirne la radicazione e l'accrescimento. La sua composizione è pertanto fondamentale per la riuscita della coltura stessa.

Sono fondamentali elementi nutritivi come azoto, potassio, calcio, fosforo, magnesio e altri in tracce come zinco, rame, ferro, iodio, cobalto. Ai sali di questi elementi vengono spesso aggiunti saccarosio e vitamine. A questi elementi viene aggiunto agar, un composto gelatinizzante avente lo scopo di solidificare il substrato.

A seconda del tipo di substrato possono essere presenti ormoni, aventi varie funzioni:

•  le citochinine contrastano la dominanza apicale e favoriscono la proliferazione
•  le gibberelline promuovono l'allungamento dei fusticini
•  le auxine favoriscono la radicazione
  
  
  

  Data l'importanza della assoluta sterilità l'acqua utilizzata deve essere ultrapura. I vari ingredienti vengono misurati con bilance di precisione, per evitare fenomeni di carenza o tossicità. Molto importante è anche il pH che viene portato al valore desiderato aggiungendo idrossido di sodio o acido cloridrico. In genere deve essere compreso tra 5.0 e 6.0, per favorire la completa disponibilità delle sostanze necessarie alla crescita.

  
  

  Sempre al fine di garantire la massima sterilità, il substrato, una volta distribuito in appositi contenitori viene posto in autoclave, dove l'azione del calore provvede ad eliminare eventuali patogeni indesiderati. I contenitori vengono chiusi e sigillati; dopo la sterilizzazione verrano aperti soltanto al momento dell'utilizzo.
  
  
  

  
  

  Impianto delle colture

  
  

  Il materiale da propagare viene prelevato da piante madri, avvalendosi di un microscopio binoculare per prelevare espianti molto piccoli, come nel caso di apici meristematici. La tecnica richiede elevata accuratezza e un buon grado di praticità ed esperienza, nonché il rispetto delle misure di asepsi.

  
  

  E' importante che il materiale venga sterilizzato mediante immersione in apposite soluzioni disinfettanti e lavato con acqua sterile. Le parti prelevate vengono poi poste sul substrato di coltura, a sua volta sterile.

  
  

  Tutte le operazioni di espianto vanno eseguite utilizzando strumenti sterili ed operando entro cappe a flusso laminare che sterilizzano l'aria che arriva sul piano di lavoro. Occorre evitare anche l'inquinamento del substrato, in quanto rappresenta un buon terreno di crescita anche per batteri e funghi.
  
  
  

  
  

  Camere di coltura

  
  

  Le piantine vengono poste in apposite camere con condizioni di temperatura, umidità e di luce controllate e variabili a seconda della specie e dello stadio di sviluppo. Le condizioni risultano così ottimali da garantire il corretto sviluppo della pianta.

  Prima di passare dal substrato gelatinoso al terreno in piena aria le piantine devono subire un graduale processo di acclimatazione. Esse si erano infatti sviluppate in condizioni ottimali e hanno limitati meccanismi di difesa da stress e parassiti. In un primo periodo viene pertanto utilizzata terra sterile fertilizzata e vengono garantiti elevati tenori di umidità. Dopo alcune settimane le piante possono crescere in condizioni normali in serra o all'aperto.

  
  
  

  

  Cappa a flusso laminare per operare in sterilità

  
  

   

   

   

   

   

   

   

  Importanza del laboratorio

  
  

  La pratica della micropropagazione, anche a scopo vivaistico, richiede l'ausilio di un laboratorio dove le varie operazioni possano essere eseguite rispettando le adeguate condizioni di sterilità. La strumentazione richiesta per poter operare è la seguente:

  
  

  • bilance di precisione, necessarie per pesare i componenti del substrato di coltura con assoluta esattezza

  • pH-metro, per la misura del pH delle soluzioni e del mezzo di coltura

  • forni e autoclavi per la sterilizzazione degli strumenti e dei substrati

  • frigoriferi per la conservazione di alcuni prodotti chimici ( vitamine, sali, ormoni)

  • vetreria, prodotti chimici, ingredienti per la preparazione del mezzo

  • apparecchi per produrre acqua ultrapura

  
  

  
  
  Le operazioni di espianto, trasferimento di meristemi, porzioni di  gemma, richiedono aree sterili dotate di cappe a flusso laminare con rigorose condizioni di pulizia e sterilità per evitare il rischio di inquinamenti e contaminazioni.

  E' poi necessaria un'area in cui le piantine possano radicare e svilupparsi, in condizioni idonee e controllate. Per l'acclimatazione, può essere presente una serra.